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La presente investigación se planteó reemplazar el uso de insecticidas sintéticos, formulando un champú bioinsecticida de aplicación canina mediante la acción biocida del aceite esencial deAmbrosia arborescens Mill (Altamisa). La planta se recolectó en las laderas del rio Tomebamba, cercanas al Campus Balzay de la Universidad de Cuenca Parroquia San Joaquín. La recolección se realizó durante los meses de Enero a Marzo del 2016. El desarrollo y formulación del producto se realizó en el Laboratorio de Biotecnología, Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Cuenca. La obtención del aceite esencial de A. arborescens se realizó mediante hidrodestilación por el método Clevenger, con un rendimiento del 0,14%. La actividad biocida se estableció en un ensayo “in vitro” ante el nematodo Panagrellus redivirus, determinándose la dosis letal (DL50) de 250 uL/mL. Debido a la moderada DL50y bajo rendimiento, se planteó como estrategia, determinar el DL50 del extracto orgánico de A. arborescens, el cual se obtuvo mediante una extracción con metanol, consiguiendo un rendimiento del 2 % y DL50de 31,25 uL/mL. De acuerdo estos resultados se procedió a realizar pruebas en pulgas de perros(Ctenocephalides canis) con el extracto de A. arborescens, estableciendo una efectividad del 100 % a la concentración de 46,875 mg/mL en el periodo de tiempo más corto, siendo esta la dosis aplicada para la formulación del champú. El extracto metanólico de A. arborescens presentó elevada actividad biocida, comparado con el aceite esencial. Esta sustancia activa es promisoria en la formulación de bioinsecticidas para mascotas.